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研究人员开发了CRISPR方法来激活剂量依赖性基因表达

UNC-Eshelman药剂学学院、国立卫生研究院和其他机构的研究人员开发了一种基于CRISPR-Cas9的系统,该系统使用化学表观遗传修饰剂(CEMs)来实现基因表达的剂量依赖性激活,而无需使用外源转录调节蛋白。

正如研究人员在周一发表在《自然生物技术》上的一项研究中所报告的那样,该系统由一种与FK506结合蛋白(FKBP)复合的催化不活跃的Cas9(dCas9)和一种与细胞表观遗传机制相互作用的分子连接的由FK506组成的CEM组成。CEMs的目的是通过招募内源性染色质激活机制的成分来激活靶基因的表达,从而消除对外源性转录激活因子的需求。

作者写道:“我们发现,CEMs根据基因的不同,上调目标内源基因座的基因表达达20倍或更多。”我们还证明了转录激活的剂量依赖性控制、跨多个不同基因的功能、CEM活性的可逆性,以及我们在基因组中同类最佳CEM的特异性。”
研究人员说,其他研究已经证明,招募外源染色质修饰机制能够以基因特定的方式控制表达水平。添加dCas9可以精确地诱导表达变化。

在之前的一项研究中,科学家证明了CEMs修饰染色质的能力,并随后抑制了工程报告基因座的基因表达。在这项新的研究中,他们开发了CEM激活(CEMa)分子,这些分子招募内源性的基因激活机制,包括CEM87、CEM88和CEM114,它们分别与组蛋白乙酰转移酶(HATs)或乙酰化赖氨酸读取器蛋白的溴代胺主要抑制剂的不同染色质修饰酶结合。CEMa家族也与基于dCas9-FKBP的系统兼容,这使得它们可以被导向任何基因。

为了检测基因表达的变化,研究人员用绿色荧光蛋白(GFP)报告基因转染了TRE3G启动子下游的HEK293T细胞,并对共表达引导RNA(gRNA)和dCas9机制的细胞进行了流式细胞术。然后他们用表达dCas9 FKBP×1或dcas9fkbp×2的质粒和三个CEMa分子中的一个来测试激活报告基因。研究人员发现,与未经处理的细胞相比,暴露48小时后,所有病例中GFP报告基因的表达均显著增加。

为了证实CEM a系统以一种受控的、FKBP依赖的方式激活GFP,他们分析了单独用CEMa处理48小时后表达dCas9的细胞,发现CEM处理没有显著改变GFP的表达。他们还通过在细胞中表达dCas9-FKBP×2,并用合成CEM87的抑制剂FK506或CEM87处理细胞,来测试激活是否是整个CEMa分子的结果,并发现CEM87处理是增加GFP表达的唯一条件。

原创文章,作者:温大人,如若转载,请注明出处:https://www.dnanews.cn/news/33397.html

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